Рефераты. Скачать реферат

Здесь Вы можете скачать рефераты и сочинения на любую тему

 
ГлавнаяРефератыРефераты по медицине Свободная субъединица хорионического гонадотропина человека как маркер синдрома Дауна
загрузка...
Свободная субъединица хорионического гонадотропина человека как маркер синдрома Дауна Печать E-mail
Скачать реферат на тему: - Рефераты по медицине

Введение

Синдром Дауна – одно из наиболее часто встречающихся врожденных заболеваний, вызванное трисомией по 21 хромосоме. По данным ВОЗ, из 1000 новорожденных генетические патологии имеют 16 детей [1], из которых 1-2 рождаются с болезнью Дауна [2]. Высокая частота и тяжесть этого заболевания определяет необходимость широкого применения пренатальной диагностики.

Пренатальная диагностика синдрома Дауна включает в себя два этапа:

Скрининговое исследование с помощью различных маркеров, предназначенное для оценки риска рождения больного ребенка.

Диагностическая процедура, направленная на выяснение кариотипа ребенка для точной постановки диагноза [3].

Клетки плода для картирования хромосом получают путем амниоцентеза (забора амниотической жидкости, содержащей некоторое количество клеток плода) или пункции хориона. Обе эти процедуры повышают риск спонтанного аборта – на 0,2 % в случае амниоцентеза и на 0,5–0,8% в случае биопсии хориона [4]. Поэтому такие процедуры требуют высокой квалификации персонала и, прежде всего, полной обоснованности ее проведения. Направление на диагностическую процедуру определяется риском наличия патологии плода, который оценивается с помощью маркеров.

В 80-х годах прошлого века была установлена целесообразность измерения концентраций ?-фетопротеина и хорионического гонадотропина в сыворотке крови беременных женщин во втором триместре [5, 6]. Это исследование позволяло выявлять 70% случаев синдрома Дауна у развивающегося ребенка на этом сроке беременности [7]. Позже пытались применять их для пренатального скрининга в первом триместре, но информативность анализа резко снижалась [8].

Были найдены другие маркеры синдрома Дауна первого триместра: свободная субъединица ?-ХГЧ (хорионического гонадотропина человека) и белок РАРР-А, а также ультразвуковой маркер – толщина воротниковой зоны (nuchal translucency), которые при совместном использовании позволяют выявлять до 80% случаев при 5% ложно-положительных результатов [8, 9].

В кровоток матери свободная ?-ХГЧ поступает вследствие секреции клетками трофобласта, а также как один из продуктов распада ХГЧ. Измерение концентрации свободной ?-ХГЧ вместе с ассоциированным с беременностью белком плазмы А (РАРР-А) и ультразвуковое измерение толщины воротникового пространства позволяют выявить до 90% случаев синдрома Дауна в первом триместре беременности. Кроме того, свободная ?-ХГЧ также продуцируется опухолевыми клетками различного происхождения.

В связи с этим молекула свободной ?-субъединицы ХГЧ широко изучалась. Картированы ее гены, изучена аминокислотная последовательность и содержание углеводов, а также методом рентгеноструктурного анализа получено представление о ее трехмерной структуре. Имеется большое количество данных о метаболизме ХГЧ, в ходе которого образуется свободная ?-субъединица.

Для определения содержания свободной ?-ХГЧ были получены и исследованы моноклональные антитела к ней. На поверхности ?-ХГЧ имеется несколько эпитопов, образующих четыре антигенных домена, только два из которых выявляются на свободной форме ?-субъединицы ХГЧ. Это создает трудности при разработке систем иммунохимической диагностики, так как в крови содержится несколько дериватов ХГЧ, выступающих в роли кросс-реактантов, причем их соотношение со свободной ?-ХГЧ составляет 97:3.

В России пренатальный скрининг синдрома Дауна в первом триместре находится на стадии апробации и оценки его диагностической значимости и до сих пор не внедрен в широкую лабораторную практику. Это объясняется новизной анализа и высокими ценами на наборы регентов для иммунометрического определения сывороточных маркеров, которые производят зарубежные компании. В нашей стране впервые начата разработка иммуноферментной тест-системы для определения концентрации свободной ?-ХГЧ в сыворотке крови беременных в первом триместре.

Структура ?-субъединицы ХГЧ и кодирующие ее гены.

ХГЧ, синтезирующийся плацентой, относится к тому же семейству гликопротеиновых гормонов, что и лютеинизирующий (ЛГ), фолликулостимулирующий (ФСГ) и тиреотропный (ТТГ) гормоны, продуцируемые передней долей гипофиза. Все они являются димерными белками, состоящими из двух неодинаковых гликопротеидных субъединиц, связанных нековалентно. Общая у всех четырех гормонов ?– субъединица, кодируемая одним геном, состоит из 92 аминокислот и содержит два N-связанных углеводных комплекса; ?-субъединица у всех гормонов разная и содержит от 114 до 145 аминокислотных остатков и 1–6 N- и O-связанных углеводных радикалов [10]. Аминокислотная последовательность первых 114 аминокислот ?-субъединицы ХГЧ гомологична ЛГ на 85%, ФСГ на 36% и ТТГ на 46%. Высокая гомология между ЛГ и ХГЧ определяет общность их биологической функции, так как они взаимодействуют с одним рецептором.

?-субъединица ХГЧ состоит из 145 аминокислот, в том числе 12 цистеинов, образующих 6 дисульфидных связей в положениях 9-57, 38-90, 34-88, 23-72, 26-110 и 93-100, причем первые три образуют «цистиновый узел» (cystine knot). Пространственная конформация и стабильность молекулы ?-субъединицы в значительной мере определяется дисульфидными связями (рис. 1), что характерно и для ?-субъединицы, имеющей очень схожую пространственную конформацию [11]. «Цистиновый узел» был также найден у трех ростовых факторов: nerve growth factor (NGF) [12], transforming growth factor ?2 (TGF- ?2) [13] и platelet-derived growth factor- ? (PDGF-?) [14].

Изображение пространственной конформации ?-субъединицы ХГЧ, полученное методом рентгеноструктурного анализа. В молекулярной структуре выделяют две «петли-шпильки», связанные дисульфидной связью 23-72, одну длинную петлю, гидрофобную коровую область, включающую в себя «цистиновый узел», и С-терминальный пептид, называемый «seat-belt» (ремнем безопасности), который охватывает ?-субъединицу, и его положение фиксируется дисульфидной связью 26-110. Дисульфидные связи показаны красным цветом.

В нативной молекуле ХГЧ ?-субъединица содержит два N-связанных олигосахарида, присоединенных к остаткам аспарагина в положениях 13 и 138, а также четыре O-связанных с остатками серина олигосахарида в положениях 121, 127, 132 и 138. Углеводы составляют 34% от всей массы молекулы ХГЧ и выделяют его из всего семейства как наиболее тяжело гликозилированный гормон [15].

Кластер генов, кодирующих ?-субъединицы ХГЧ и ЛГ, локализован на 19-й хромосоме в области 13.3 длинного плеча [16, 17]. В нем содержится шесть копий гена ?-ХГЧ, расположенных друг за другом в прямой и обратной последовательности [16] и один ген ?-ЛГ на правом конце кластера. Присутствие нескольких активных генов ?-ХГЧ определяет высокий уровень продукции ХГЧ в начале беременности.

Свободная ?-субъединица и другие метаболические формы ХГЧ в кровотоке

Молекула ХГЧ и ее свободные ?- и ?-субъединицы секретируются клетками трофобласта в ходе его нормального развития и при трофобластических заболеваниях, клетками опухолей различного происхождения, а также в небольших количествах гипофизом [17]. Секреция свободных субъединиц происходит либо вследствие независимой регуляции синтеза субъединиц, либо из-за их несостоявшейся ассоциации. Существуют данные, подтверждающие обе эти причины. В пользу первой говорит то, что соотношение количеств ?- и ?-субъединиц ХГЧ изменяется в процессе развития плаценты, что позволяет предполагать существование разных путей физиологической регуляции синтеза двух субъединиц ХГЧ. Имеются данные о том, что в плаценте в первом триместре беременности уровень мРНК ?-субъединицы был в 2 раза выше, чем мРНК ?-субъединицы ХГЧ. Это коррелировало с уровнем ?- и ?-субъединиц, доказывая то, что продукция ХГЧ контролируется на претрансляционном уровне. В плаценте конца беременности наблюдалось заметное снижение уровней мРНК обеих субъединиц, но соотношение субъединиц ? : ? возрастало до 12 : 1 [18]. Таким образом, регуляция продукции субъединиц ХГЧ происходит независимо, но в целом они продуцируются в количестве, достаточном для обеспечения возможности образования биологически активного гетеродимера. Однако имеются данные, указывающие на существование механизмов, препятствующих образованию димера ХГЧ. Одним из путей нарушения взаимодействия субъединиц является гипергликозилирование ?-субъединицы, что мешает ее способности вовлекаться в образование полной молекулы ХГЧ [19].

Катаболизм молекулы хорионического гонадотропина – это другой путь поступления свободной ?-субъединицы в кровоток. Деградация ХГЧ начинается с одиночного расщепления между 47 и 48 аминокислотами ?-субъединицы [20]. Это приводит к резкой потере функциональной активности ХГЧ и ее стабильности в крови (с 1300 часов до 22) [21]. ХГЧ с расщепленной ?-субъединицей не способен взаимодействовать с рецепторами ЛГ/ХГ клеток желтого тела и стимулировать продукцию прогестерона, и, возможно, выступает в роли антагониста нативного гормона [22]. Расщепление ХГЧ связывают с плацентарными макрофагами, лейкоцитарная эластаза которых чувствительна к определенному строению длинной петли ?-ХГЧ: последовательность гидрофильных аминокислот сменяется последовательностью гидрофобных аминокислот (рис.2). В связи с этим появление свободной ?-ХГЧ в крови может зависеть от количества или активности плацентарных макрофагов [12].

После распада субъединиц, расщепленная молекула ?-ХГЧ теряет С-терминальный пептид (область 93-145 аминокислот) и деградирует до конечного продукта распада ХГЧ – ?-кор-фрагмента (два участка ?-субъединицы, 6-40 и 55-92, соединенные четырьмя дисульфидными связями) (рис.3). Катаболизм ХГЧ приводит к появлению в крови только расщепленной ?-ХГЧ.

Все эти процессы приводят к тому, что в плазме и моче беременных женщин обнаруживается большое количество дериватов (метаболических форм и предшественников) хорионического гонадотропина. Эта группа включает в себя нативный ХГЧ, ХГЧ с расщепленной ?-субъединицей, ХГЧ без С-терминального выступа, свободную -субъединицу, свободную гипергликозилированную ?-субъединицу, свободную ?-субъединицу, расщепленную свободную ?-субъединицу и ?-кор-фрагмент [23].

Содержание свободной ?-субъединицы ХГЧ в биологических жидкостях в норме и при патологии

Концентрации ХГЧ – нативного и с расщепленной ?-субъединицей – в плазме крови и моче возрастают в первом триместре беременности, удваиваясь каждые 48 часов, и достигают пика около десятой недели беременности [24]. Концентрация нативного ХГЧ снижается с десятой по шестнадцатую недели беременности, достигая приблизительно 20% от пиковой концентрации, и остается около этого уровня до конца беременности [25]. В среднем ХГЧ с расщепленной ?-субъединицей составляет около 9% от всех дериватов ХГЧ в плазме на втором нормальной месяце беременности и возрастает в среднем до 21% на девятом месяце. Несмотря на в среднем низкое содержание расщепленного ХГЧ, индивидуально оно может очень сильно меняться [26]. Изменения концентрации гормона в течение беременности отражают его основную функцию – поддержание продукции прогестерона желтым телом до того как плацента не возьмет эту функцию на себя [27].

Концентрация свободной ?-ХГЧ в сыворотке крови беременных очень низка: около десятой недели беременности оно максимально (1-3% от всех дериватов ХГЧ), а к девятому месяцу понижается до 0,5%. Более высокое содержание свободной ?-субъединицы наблюдается в моче, где достигает 9% от общего количества дериватов [20].

Содержание в крови и моче ХГЧ с расщепленной ?-субъединицей, свободной ?-субъединицы и ?-кор-фрагмента значительно изменяется при синдроме Дауна у плода, беременности, осложненной преэкламсией (поздним токсикозом) и при трофобластических заболеваниях (пузырном заносе, трофобластических опухолях и хориокарциноме) [28-31, 34].

В пренатальной диагностике корреляция концентрации какого-либо маркера, в том числе свободной ?-субъединицы ХГЧ, с патологией оценивается статистически – по вкладу в вероятность рождения больного ребенка, рассчитываемую на основании нескольких факторов. Все факторы риска, биохимические и ультразвуковые, оценивают в единицах МoМ (multiplies of median, кратности медиане). Затем с помощью специальных статистических программ рассчитывается вероятность рождения ребенка с синдромом Дауна с учетом возрастного риска [32, 33].

С 1993 года были проведены скрининговые исследования, в которых была установлена целесообразность использования свободной ?-ХГЧ для скрининга синдрома Дауна в первом триместре [8]. Данные этих исследований представлены в табл. 1.

Таблица 1

Содержание свободной ?-субъединицы ХГЧ в крови женщин в первом триместре беременности при наличии синдрома Дауна у плода.

Авторы Количество случаев синдрома Дауна Среднее значение (МоМ)
Macri e.a. [34] 38 2.20
Macintosh e.a. [35] 21 2.10
Kranz e.a. [8] 22 2.09
Haddow e.a. [36] 48 2.13

Таким образом, при синдроме Дауна концентрация свободной ?-ХГЧ в 2 с лишним раза выше, чем значение для выборки в целом.

Характеристика эпитопов ?-субъединицы ХГЧ

Развитие высокоспецифичных и чувствительных иммунохимических методов для определения свободной ?-ХГЧ в крови основано на отборе моноклональных антител, способных отличать свободную ?-ХГЧ от остальных метаболитов гормона. Антитела, специфически связывающие свободную ?-субъединицу, впервые были получены в 1981 г. [37]. После этого было описано большое количество антител, однако четкое представление о расположении антигенных областей ?-ХГЧ появилось только после изучения ее кристаллической структуры. Многочисленные исследования методами биохимической, в т.ч. энзиматической модификации, изучение кросс-реактивности в конкурентных иммуноанализах, с помощью искусственных синтетических пептидов и рентгеноструктурного анализа привели к выяснению эпитопной карты ?-ХГЧ, свободной ?-субъединицы и продуктов ее деградации.

Установлено, что свободная ?-ХГЧ имеет четыре пространственно разделенных антигенных домена [38]. Два из них локализованы в С-терминальной области ?-ХГЧ и являются небольшими слабо иммуногенными областями, состоящими каждая из одного эпитопа (113-116 и 137-144 аминокислотные остатки) [39]. Третий домен также представлен одним эпитопом, локализованным вблизи от «цистинового узла» с аргинином в положении 60 в качестве главной детерминанты, и является также слабо иммуногенным. Четвертый домен демонстрирует высокую иммуногенную активность и представлен четырьмя эпитопами в области ?-кор-фрагмента. Кроме того, к этому домену также относится один из двух эпитопов, специфичных только для свободной ?-ХГЧ (табл. 2) [40].

Таблица 2

Распределение эпитопов на дериватах ХГЧ.

«+» – присутствие эпитопа на молекуле, «–» – отсутствие.

Эпитоп ХГЧ

Свободная

?-ХГЧ

?-кор-

фрагмент

?1 + + +
?2 + + +
?3 + + +
?4 + + +
?5 + + +
?6 - + +
?7 - + +
?8 + + -
?9 + + -
?10 - - +
?11 - - +
?12 - - +
?13 - - +

Из этих данных видно, что на свободной ?-ХГЧ выявляются только два эпитопа (?6 и ?7), антитела к которым не взаимодействуют с молекулой ХГЧ.

Коммерческие тест-системы для определения содержания свободной ?-субъединицы ХГЧ в сыворотке крови

Из вышесказанного ясно, что сложность создания иммунометрической тест-системы для определения концентрации свободной ?-ХГЧ связана с большим количеством метаболических форм ХГЧ, содержащихся в крови, и перекрестной реакцией антител с ними. В связи с тем, что ?-ХГЧ составляет не более 3% от всех дериватов ХГЧ, для конструирования одностадийной системы необходимы высокочувствительные и специфичные только к свободной ?-субъединице антитела [23]. По последним данным, охарактеризовано всего два антитела, специфически связывающиеся со свободной ?-ХГЧ (табл. 2).

При обзоре коммерческих тест-систем (табл. 3), оказалось, что только в одной из них используются два антитела, специфичные к свободной ?-ХГЧ, что позволило производителю (Wallac OY, Финляндия) [41] создать одностадийный вариант анализа. Все остальные компании предлагают двустадийный анализ. Можно предположить, что во всех этих системах только нижнее антитело имеет специфичность к свободной ?-субъединице, а верхнее – к полной молекуле ХГЧ.

Таблица 3

Аналитические характеристики коммерческих тест-систем для определения концентрации свободной ?-субъединицы ХГЧ в сыворотке крови («–» означает, что данные не найдены)

Комания Антитела Метод анализа

Диапазон,

чувствительность,

хук-эффект (мМЕ/мл)

Wallac OY, Финляндия

Оба к свободной

?-ХГЧ

Одностадийный флуороиммуно-

метрический

0-200

0,2

2000

DPC, США Только нижнее к свободной ?-ХГЧ Двустадийный ИФА

до 80

0,04

нет

IBL, Германия - Двустадийный ИФА

до 50

0,5

нет

Genemed Biotechnologies, США - Двустадийный ИФА

0-250

 
Ещё статьи...